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组织研磨仪在猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测样品方法中的应用

      猪瘟检测,主要监测手段是实时荧光定量PCR仪,大致流程步骤为:样品研磨(制备样品)----磁珠提取(提取DNA,RNA)----结合专用试剂盒上实时荧光定量PCR仪检测。而在样品研磨过程中采用新锐精仪组织研磨仪都可以很好运用到这一环节中来,下面以DHFSTPRP-24为例子

1 器材和设备

1.1多样品组织研磨仪DHFSTPRP-24

1.2离心管

1.3 高速台式冷冻离心机:最大离心力12000g以上

1.4冰箱

1.5 荧光PCR检测仪

1.6 微量移液器和吸头


2 样品的采集

2.1采样注意事项

      采样及样品前处理过程中应戴一次性手套,样本不得交叉污染。

2.2采样工具

      扁桃体采样器:鼻捻子、开口器和采样抢。使用前均应用3%氢氧化钠溶液浸泡5Min~10Min,经清水冲洗。

      灭菌牙签和0.5ml或1.5ml离心管经(121±2)℃,高压灭菌15Min;剪、镊经160℃干烤2h。

2.3 采样方法

2.3.1 活体样品

      固定活猪的上唇,用开口器打开口腔,用采样抢采取扁桃体样品,用灭菌牙签挑至0.5ml或1.5ml离心管并作标记,编号送实验室。取待检样品,按1:5倍体积加入DEPC水,于研钵或组织匀浆器中充分研磨,3000g离心15min,取上清液转入离心管中编号备用。

2.3.2 内脏样品

      采取病死猪各种脏器(淋巴结、胰脏、脾脏、回肠、肝脏和肾脏)装入一次性塑料袋或其他灭菌容器,编号,送实验室。取50mg~100mg待检样品,按1:5倍体积加入DEPC水,于研钵或组织匀浆器中充分研磨,3000g离心15min,取上清液转入离心管中编号备用。

2.3.3  4%EDTA抗凝血

       用无菌注射器直接全血,注入含1/10 4%EDTA溶液的无菌容器中,充分混匀后编号备用。

2.3.4 排泄物

      挑取少许粪便样本于离心管中,加入适量生理盐水,振荡混匀,室温3000g,离心管15min,取上清液转入离心管中编号备用。其余液体排泄物直接转入离心管编号备用。

2.3.5 细胞培养物

      细胞培养物冻融3次,转入离心管中编号备用。

2.3.6 存放与运送

      采集或处理的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24h;若需长期保存,应放置-70℃冰箱,但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。采集的样品密封后,采用保温壶或保温桶加冰密封,在6h~8h之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。


3.实时荧光RT-PCR检测
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